مطالعه بیوسیستماتیکی جمعیت های گونه (ronniger) jalas thymus eriocalyx در ایران

مقدمه انتخاب بهترین تیپ شیمیایی در بین جمعیت های طبیعی گیاهان دارویی اولین، مهمترین و البته پر هزینه ترین مرحله در طی اهلی کردن این گیاهان است. اولین مرحله برای دستیابی به اهداف اصلاحی، آگاهی از تنوع موجود در بین جمعیت های زراعی و وحشی است. در مورد گیاهان دارویی باید اذعان داشت که 75-60 درصد ارقامی که امروزه در کشت و صنعت ها کشت و تولید می شوند از طریق روش های ساده انتخاب در بین جمعیت های وحشی یا توده های بومی بدست آمده اند که البته کارایی انتخاب به وجود و شناخت دقیق تنوع بستگی دارد (bernath, 1986 & 2002؛ franz, 1993 ؛ mathe, 1986 ؛nemeth,2000). خانواده نعناع، بعنوان یکی از مهمترین خانواده های گیاهی با پراکنش جهانی و نیازهای اکولوژیکی بسیار متفاوت از اهمیت خاصی برخودار است. اغلب نعناعیان تولید کننده ترپن ها و ترکیبات مفید دیگر هستند که اغلب در غدد اپیدرمی اندام های هوایی ذخیره می-شوند (هی، 1379). آویشن(thymus) یکی از مهمترین جنس های خانواده نعناع با حدود حداقل 220 گونه در جهان می باشد. ماده موثره آویشن اسانس می باشد که قسمت اعظم آن را فنل ها (20 تا 80 درصد) و هیدروکربن-های مونوترپنی (مثل پارا-سیمن و گاما-ترپینن) تشکیل می دهد. به طور طبیعی تیمول جزء اصلی فنلی در آویشن است و کارواکرول نیز یک جزء فرعی می باشد (leung, 1996). از آنجا که ژرم پلاسم های طبیعی بعنوان ذخیره و ثروت ملی هر کشور به حساب می آیند، لذا، بررسی، اشاعه و معرفی آنها دارای اهمیت دو چندان می باشد. گونه آویشن thymus eriocalyxبعنوان یکی از این ذخائر ژنتیکی با توجه به گسترد گی بالا در کشور از این حیث مستثنی نیست. نظر به اهمیت دارویی و صنعتی این گیاهان و نیز فقدان اطلاعات بیوسیستماتیکی جامع و دقیق در مورد گونه های این جنس در ایران، به ویژه گونه thymus eriocalyx که یک گونه انحصاری برای فلات ایران است، انجام مطالعه بر روی این گونه ضروری به نظر می رسد. گونه های جنس آویشن در ترکیبات مونوترپنی اسانس روغنی خود تفاوت دارند و این تنوع ترکیبات ثانویه پایه ژنتیکی دارد و حضور شکل های متنوع ترکیبات ثانویه با پایه ژنتیکی، یک سیستم جالب برای کشف روابط ژنتیکی تنوع ترکیبات ثانویه، خصوصاً نقش این تنوع در میانجیگری برهم کنشهای بین گونه ای و تعیین تنوع در فراوانی نسبی در میان چشم اندازها فراهم می کند (stahl-biskup, 2002). تعداد واقعی کموتایپهای جنس آویشن شناخته نشده است، زیرا ترکیب اسانس آن ها به همان صورت که می تواند تحت تأثیرعوامل ژنتیکی قرار گیرد، می تواند تحت تاثیر عوامل محیطی هم واقع شود. به منظور تصدیق وجود یک کموتایپ معین، لازم است که شیمی اسانس، تحت گستره ای از شرایط مختلف مطالعه شود. ریخت شناسی گیاه لزوماً با ترکیب اسانس ارتباطی ندارد. آزمایش های انجام شده تحت شرایط کنترل شده، معلوم کرده اند که تغییرات عوامل محیطی نظیر دما، تابش نور و طول روز می توانند بر میزان اسانس تولیدی و کیفیت آن اثر داشته باشد. فرض بر این است که هرگاه افراد یک گونه در زیستگاهای مختلف اکولوژیکی قرار گیرند، می توانند از نظر فنوتیپیکی و ژنوتیپیکی تغییراتی را متحمل شوند. هدف از انجام این پایان نامه، شناخت تغییرات حاصل از قرار گرفتن افراد یک گونه در شرایط مختلف اکولوژیکی است که می تواند به صورت تنوع درون گونه ای در سطوح مختلف تجلی یابد. برای تشخیص نوع تنوع از روشهای مختلف استفاده می شود. بیوسیستماتیک می تواند به عنوان کاربرد تاکسونومیکی ژن اکولوژی باشد، یعنی بررسی تنوع ژنوتیپی و فنوتیپی گونه ها در رابطه با محیط-هایی که در آن به سر می برند. هر نوع داده ای که اختلاف های یک تاکسون را از تاکسونی دیگر نشان دهد، برای تاکسونومی ارزشمند است. برای دستیابی به بهترین رده بندی طبیعی، بهتر است از یافته های مربوط به منابع گوناگون استفاده شود. افزون بر آن تا کنون ابزارها، فنون و تخصص های مورد نیاز متخصصان تاکسونومی فراهم شده اند. این کمک های جدید، اغلب، یافته های پر ارزشی را برای به کارگیری گسترده در رده بندی فراهم کرده اند. با توجه به اینکه در سال های اخیر از نشانگرهای مولکولی برای مطالعات پایه ای و کاربردی استفاده شده است و فرصت مناسبی را برای بررسی تنوع و تفاوت موجودات در سطح dna امکان پذیر کرده است و همچنین به دلیل فقدان مطالعات مولکولی در گونه های جنس thymus در ایران، در این مطالعه، برای تشخیص تنوع ، علاوه بر بررسی مورفومتری، مطالعات سیتوژنتیکی و مولکولی انجام شد که به ویژه در تعیین روابط ژنتیکی بیوسنتز اجزای موجود در اسانسهای افراد جمعیت های گونه مورد بررسی و ارتباط آن ها با عوامل محیطی، فلوریستیکی، مورفومتری و.... اقدام شد. از سوی دیگر برای تشخیص وجود تنوع از مارکر فلوریستیکی هم استفاده شد. همچنین الگوی پراکنش جغرافیایی و عوامل اکولوژیکی موءثر بر آن مورد مطالعه قرار گرفت. علاوه بر آن سعی گردید نشان داده شود که اساس ژنتیکی بیوسنتز اجزای موجود در اسانسها را می توان با ترکیبی از مطالعات اکولوژیکی، ژنتیکی و تجزیه اسانس ها با استفاده از مارکر های فلوریستیکی و مولکولی روشن نمود. روش کار 1- مطالعات کتابخانه ای در بررسی کتابخانه ای، عمده مطالعات روی مقالات و فلورهای مربوط به تیره نعناع و خصوصاً جنس thymus در ایران و کشورهای مجاور بود. فلور ایرانیکا، فلور عراق، فلور ترکیه و کتاب thyme از جمله مهمترین منابع فلوریستیک خارجی و فلور رنگی ایران و کتاب آویشن و مرزه های ایران جزو منابع فارسی مورد مطالعه بود . 2- مطالعات میدانی 2-1- معرفی مناطق مورد بررسی در این تحقیق با توجه به مناطق پراکنش گونه t. eriocalyx و مراجعه به این مناطق پنج استان در کشور جهت بررسی انتخاب شد. این استانها شامل استان همدان(دو منطقه رویشی مختلف)، استان مرکزی(دو منطقه رویشی مختلف)، استان کرمانشاه(یک منطقه رویشی)، استان لرستان(سه منطقه رویشی مختلف) و استان کردستان(دو منطقه رویشی مختلف) می باشد که در مجموع 10 منطقه رویشی مختلف و 10 جمعیت از این گونه را در بر می گیرد. ویژگیهای مختلف تک تک این مناطق از جنبه های مختلف شامل موقعیت جغرافیایی، زمین شناسی و خاک شناسی،اکولوژیکی و اقلیم (شامل میانگین بارندگی سالانه و فصلی، میزان بارندگی ماهانه، تعداد روزهای یخبندان، رطوبت نسبی، پارامترهای پنجگانه دمایی، تبخیر، تعرق و طبقه بندی اقلیمی) بررسی شدند. 2-2- تعیین زیستگاههای ویژه و جمع آوری نمونه ها در این بررسی جهت انتخاب نمونه ها، تعیین زیستگاه های ویژه، بررسی عوامل بوم شناسی، بررسی فلوریستیکی، ویژگی های ریختی، بررسی های سیتوژنتیکی و مولکولی آویشن مورد بررسی (thymus eriocalyx(ronniger) jalas) در ایران از روش.d.s.s (determination of special station) (عطری و همکاران، 1386) استفاده شد. در این روش تاکسون هایی مورد بررسی قرار می گیرند که چند زیستگاهه باشند و پراکندگی و گسترش زیادی داشته و در زیستگاه هایی با شرایط اکولوژیکی مختلف حضور داشته باشند. در این روش ابتدا با استفاده از منابع در دسترس نسبت به تعیین محل های رویش تاکسون مورد بررسی اقدام نموده و سپس با مراجعه به رویشگاهها نسبت به تعیین زیستگاه های عمومی تاکسون مورد بررسی اقدام می گردد. در مرحله بعد، در هر یک از زیستگاه های عمومی بر اساس حضور فرد گونه مورد بررسی و با استفاده از روش سطح حداقل مبتنی بر روش سطح- گونه و بر اساس منحنی سطح – گونه (gordon, 1971) زیستگاه های ویژه افراد گونه مورد بررسی تعیین می شود. روش .d.s.s بر این مبنا و اصل استوار است که مجموع گونه هایی که دارای سرشت اکولوژیکی یکسانی هستند، با ترکیب گونه ای ویژه ای در یک زیستگاه معین گرد هم می آیند. بنابر این، ترکیب گونه ای یکنواخت سطحی از پوشش گیاهی که بر اساس حضور فرد یا افراد یک گونه ی معین در شرایط اکولوژیک یکسان، تعیین می گردد، می تواند به عنوان زیستگاه ویژه ی فرد مورد بررسی در نظر گرفته شود. همچنین، عوامل اکولوژیک از قبیل: ارتفاع، جهت و درصد شیب نیز یادداشت برداری شد و پارامترهای اقلیمی مناطق مورد مطالعه نیز استخراج گردید. نمونه هایی از خاک هر زیستگاه ویژه تا عمق 30 سانتی متری جهت شناسایی بافت خاک و تعیین برخی خصوصیات آن، نمونه برداری شد. 2-3- جمع آوری داده های فلوریستیک- اکولوژیک پس از تعیین زیستگاه های ویژه، از آنجایی که الگوی رویش تحت تأثیر عوامل محیطی نظیر ارتفاع، خاک، بستر، توپوگرافی، عوامل آنتروپوژن و ... می باشد (perkins, 1999)، در فرم مربوطه به ذکر مشخصات مورد نظر (تاریخ استقرار نمونه، کد قطعه نمونه، سطح حداقل، ارتفاع، درصد پوشش، درصد شیب، جهت شیب، نوع بستر، ویژگی های خاک و دیگر توضیحات لازم) و جمع آوری نمونه های گیاهی و یادداشت ضرایب براون-بلانکه شامل ضریب جامعه پذیری و فراوانی- چیرگی2 هر یک از گونه های گیاهی و برداشت نمونه ی خاک تا عمق 30 سانتی متری اقدام می شود. 3- مطالعات آزمایشگاهی 3-1- روش بررسی فلوریستیک و تعیین صفات ریختی در این مرحله کلیه گونه های گیاهی همراه گونه مورد نظر برای شناسایی و آنالیز فلور یستیک جمع آوری شد. به منظور ارزیابی صفات ریختی از هر زیستگاه ویژه پنج فرد کامل گیاهی در فصل گلدهی گیاه انتخاب و 33 صفت کمی و کیفی با پنج تکرار برای هر صفت بررسی شد. 3-2- روش مطالعات سیتولوژی ژرم پلاسم مورد استفاده در این بررسی شامل 10 جمعیت از گونه t.eriocalyx است که نمونه های بذردار 5 فرد از 10 جمعیت در مناطق مورد بررسی در ماه های خرداد تا مرداد جهت ارزیابی های سیتولوژیکی جمع آوری شد. 3-3-روش بررسی تنوع فیتوشیمیایی ژرم پلاسم مورد استفاده در این بررسی شامل 50 فرد از ده جمعیت از گونه t. eriocalyx است .در این مرحله اندامهای هوایی 5 فرد(بوته) از گونه thymus eriocalyx در مرحله گلدهی در هر یک از زیستگاههای ویژه(در اینجا 10 زیستگاه ویژه) جهت بررسی های شیمیایی جمع آوری شد. -3-4- مطالعات آناتومیکی مطالعات آناتومیکی بافت ساقه و برگ t. eriocalyx پس از جمع آوری نمونه ها از محل طبیعی آن ها انجام شد. 3-5- بررسی مولکولی مواد گیاهی در این آزمایش در کل با توجه به اینکه گیاه آویشن، گیاهی دگرگشن است شامل پنج فرد از ده جمعیت در مناطق مورد بررسی بود که درسال 1389 و در مرحله رویشی از برگ های تازه و جوان بوته ها برداشت شدند. نمونه ها پس از بر داشت در محل جمع آوری در داخل ازت مایع قرار داده شدند. یک نمونه آویشن باغی نیز به عنوان شاهد از باغ گیاهشناسی موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور جمع آوری شد. پس از انتقال نمونه ها به آزمایشگاه، نمونه ها در دمای 80- درجه سانتی گراد تا هنگام استخراج dna نگهداری شدند. نتایج 4-1- نتایج حاصل از بررسی ویژگی های کلی اقلیمی در رویشگاه های مختلف بررسی پارامترهای هواشناسی و اقلیمی مناطق مورد مطالعه نشان دهنده تحمل واستقرار گونه ی مورد مطالعه در مناطقی با شرایط اقلیمی به شرح ذیل می باشد: - دامنه ی درجه حرارت متوسط سالانه ی بین 1/16-8/9 درجه سانتی گراد - دامنه متوسط درجه حرارت حداقل سالانه ی بین 03/10-6/2 درجه سانتی گراد - دامنه متوسط درجه حرارت حداکثر سالانه بین 40-8/16 درجه سانتی گراد - دامنه متوسط میزان بارندگی سالانه بین 4/655- 8/288 میلی متر - دامنه تعداد روزهای یخبندان بین 122-44 روز دامنه اقلیمی به روش دمارتن به ترتیب از نوع مدیترانه ای، مدیترانه ای فراسرد، نیمه خشک، نیمه-خشک فراسرد، نیمه مرطوب. 4- 2- نتایج خاکشناسی بررسی ویژگیهای کلی خاک در رویشگاههای مختلف نشان داد که گیاه دارویی thymus eriocalyx عموماً در خاک های کم عمق تا نیمه عمیق و بیشتر در خاکهایی با بافت متوسط (silt loam - loam) استقرار می یابد و تنها در موارد محدودی در منطقه حفاظت شده خان گرمز در استان همدان و همچنین گردنه آریز در استان کردستان، درخاکهایی با بافت سنگین (clay loam) مشاهده می شود. این گیاه در phهای خنثی تا قلیایی متوسط بین اعداد 1/8-4/7 می تواند اسیدیته را تحمل نماید. 4-3-بررسی ویژگی های توپوگرافیک در رویشگاه های مختلف بررسی ویژگی های توپوگرافیک گونه مورد بررسی در رویشگاه های مختلف نشان داد که این گونه در دامنه ارتفاعی بین 2500-1825 متر گسترش دارد و بیشترین پراکندگی را در دامنه ارتفاعی بالای 1800 متر دارا می باشد، همچنین گونه ی مورد مطالعه(thymus eriocalyx) در شیب های شمال، شرق، شمال شرقی، شمال غربی، جنوب شرقی انتشار دارد و بیشترین پراکندگی این گونه به ترتیب در شیب های شمالی و شمال غربی می باشد. همچنین این گونه در شیب های با دامنه درصد شیبی15 تا 70 درصد پراکنش دارد که بیشترین پراکندگی را در شیب های با درصد 45 به بالا را به خود اختصاص می دهد و در طبقات شیب نسبتا تند تا خیلی تند جای می گیرد. 4-4- نتیجه و بحث بررسی های فیتو شیمیایی بالاترین بازده اسانس در میان افراد جمعیت های 10 گانه متعلق به فرد اول از جمعیت p2( 09/4%) و پایین ترین بازده اسانس متعلق به فرد دوم از جمعیت p10( 21/0%) می باشد. همچنین بالاترین میانگین بازده اسانس در بین 10 جمعیت مورد بررسی متعلق به جمعیت p5 (04/3 )می باشد. به طور کلی در گونه مورد بررسی 31 ترکیب در اسانس روغنی افراد 10 جمعیت مورد بررسی شناسایی شد. در تجزیه کلاستر حاصل از نرم افزار mvsp با روش upgm و ضریب average distance) (که بر اساس درصد تمامی ترکیبات تشکیل دهنده اسانس افراد 10جمعیت مورد مطالعه حاصل شد ، مشاهده گردید که افراد جمیت های ده گانه در 9 کلاس مختلف قرار گرفتند که با توجه به ترکیبات تشکیل دهنده هر کلاس می توان گفت این 9 گروه 9 کموتایپ برای این گونه به شرح زیر می باشند:1- کموتایپ ژرانیول/ ژرانیل استات شامل افراد 2-7، 3-7، 4-7 و 5-7. 2- کموتایپ ژرانیول شامل فرد 4-1. 3- کموتایپ لینالول/ ژرانیول/ ژرانیل استات شامل فرد 3-1. 4- کموتایپ لینالول شامل افراد 2-1، 1-4 ، 3-4،2-4، 3-10، 4-4، 2-9، 5-4، 5-9، 3-9، 4-9، 5-1، 4-2، 1-7، 2-8، 5-10، 4-10، 1-10، 5-8 و 1-8. 5- کموتایپ آلفا-ترپینئول/1و8-سینئول شامل افراد 1-9 و 2-10. 6- کموتایپ ژرانیل استات شامل افراد 1-6، 3-6 و 4-6. 7- کموتایپ ژرانیول/تیمول/بورنئول/1و8-سینئول شامل افراد 2-6 و 5-6. 8- کموتایپ تیمول/لیمونن شامل فرد 4-8. و 9- کموتایپ تیمول/پاراسیمن/بورنئول شامل افراد 1-1، 3-3، 1-2، 5-5، 5-2، 3-5، 4-5، 3-2، 1-3، 2-3، 5-3، 2-2، 1-5، 4-3، 2-5 و 3-8. در میان کموتایپ های مذکور کموتایپ لینالول و ژرانیول در مطالعات قبلی برای این گونه گزارش شده بود. ((sefidkon, f et al, 2005 و سایر کموتایپ ها به عنوان کموتایپ های جدید برای این گونه معرفی می گردد. 7 کموتایپ معرفی شده برای گونه thymus eriocalyx، در دیگر گونه های جنس آویشن تا به حال گزارش نشده است. 4-5- نتایج و بحث مطالعات رخدادشناسی مطالعات رخدادشناسی گیاه thymus eriocalyx در مناطق مورد بررسی نشان داد که شروع مرحله رویشی گیاه مورد مطالعه در مناطق مورد بررسی به طور همزمان آغاز نمی گردد؛ به نحوی که مرحله رویشی گیاه از نیمه دوم فروردین ماه در مناطق p1 ، p2، p3 ،p6 ،p7 p8, ، p9 و p10و نیمه اول اردیبهشت در مناطق p4 و p5 آغاز می شود. گلدهی از اواخر اردیبهشت ماه در مناطق p1 ، p2، p3 ،p6،p7 p8, ، p9 و p10 و نیمه اول خرداد در مناطق p4 وp5 آغاز و تا اواخر خرداد ماه ادامه می یابد. رسیدن بذرها از اوایل تیر ماه در مناطق p1 ، p2، p3 ،p6 ،p7 p8, ، p9 و p10شروع و تا اوایل شهریور ماه در مناطق p4و p5 ادامه دارد. 4-6- نتایج و بحث مطالعات فلوریستیکی درکل 150 گونه، به عنوان گونه همباش thymus eriocalyx شناسایی شد که بیشترین شکل زیستی گونه های همباش آویشن مورد مطالعه، طبق رده بندی رانکیر مربوط به شکل زیستی همی کریپتوفیت(43 در صد) و کمترین شکل زیستی مربوط به فانروفیت ها(4 درصد) می باشد. آنالیز زیستگاه های ویژه بر اساس ترکیب رستنی ها(به عنوان مارکر فلوریستیک)، منجر به گروه بندی زیستگاه ها در7 گروه متمایز به همراه گونه تشخیصی هر گروه به شرح زیر شد: گروه 1 شامل زیستگاه ویژه 4 باگونه تشخیصی:acer monspessulanum l subsp cinerascens گروه 2 شامل زیستگاههای ویژه 6 و8 با گونه تشخیصی: astragalus zoharyi eig گروه 3 شامل زیستگاههای ویژه 7 و9 با گونه تشخیصی: . scutellaria pinnatifida a. hamilt گروه 4 شامل زیستگاههای ویژه 2 و5 با گونه تشخیصی: rosularia sempervirum (m.b) berger var:sempervirum گروه 5 شامل زیستگاه ویژه 1 با گونه تشخیصی: dionysia leucotricha bornm. گروه 6 شامل زیستگاه ویژه 3 با گونه تشخیصی: lindl. quercus brantii گروه 7 شامل زیستگاه ویژه 10 با گونه تشخیصی: astragalus globiflorus boiss. 4-7- نتیجه و بحث مطالعات مورفومتری در دندروگرام حاصل از نرم افزار mvsp با روش upgm و ضریب average distance که بر اساس کلیه ویژگی های ریخت شناسی کمی و کیفی و بر اساس میانگین صفات در افراد هر جمعیت، حاصل شده است،جمعیت ها در 7 گروه اصلی به شرح زیر قرار گرفتند. 1-گیاهان گروه 1 دارای کمترین طول و عرض برگ گل آذینی و ساقه ای و بیشترین نسبت طول به عرض برگ گل آذینی و کمترین عرض کاسه و کمترین طول دندانه های لبه پایینی کاسه. 2- گیاهان گروه 2 دارای کمترین طول گیاه و کمترین طول ساقه گل دهنده، بیشترین عرض برگ ساقه ای و کمترین نسبت طول به عرض برگ ساقه ای، شکل راس برگ ساقه ای نوک گرد و رنگ گلند های نارنجی. 3- گیاهان گروه 3 دارای شکل برگ گل آذینی تخم مرغی. 4- گیاهان گروه 4 دارای بلند ترین طول کاسه، بلند ترین طول دندانه های لبه پایینی کاسه و دارا بودن رنگ گلند های زرد. 5- گیاهان گروه 5 دارای شکل برگ گل آذینی مشابه، طول و عرض برگ گل ساقه ای تقریبا هم اندازه و دارا بودن تراکم کرک سطح رویی برگ متوسط. 6- گیاهان گروه 6 دارای عرض برگ گل آذینی برابر، طول کاسه و لوله کاسه برابر و طول دندانه های لبه بالایی کاسه برابر. 7- گیاهان گروه7 دارای طول برگ ساقه ای برابر، نسبت طول به عرض برگ ساقه ای و طول دمبرگ برابر. 4-8- نتایج حاصل از تجزیه و تحلیل عوامل اکولوژیک موثر در گروه بندی زیستگاه های ویژه نتایج حاصل از تجزیه و تحلیل عوامل اکولوژیک با روش cca نشان داد که عوامل اکولوژیک مختلفی در گروه بندی و ایجاد تنوع زیستگاه های ویژه نقش دارند که در میان آنها عامل عمق خاک مهمترین عامل در گروه بندی زیستگاه ها و ایجاد گروه های فنتیکی است و بر این اساس دو پدودیم قابل شناسایی و معرفی می باشد. 1-پدودم خاک های کم عمق با جمعیت های (, p3,p2, p1 p6, p5, p4 و p8 ) 2- پدودم خاک های نیمه عمیق با جمعیت های(p10, p9, p7 ). 4-10- نتایج و بحث و بررسی تنوع ژنتیکی( داده های مولکولی) با استفاده از 7 آغازگر مورد استفاده در مجموع 71 باند یا مکان ژنی تولید شد که از لحاظ اندازه در بازه طولی bp300bp-3000 بودند که از بین آن ها 3 باند در بین تمام نمونه ها یک شکل(مونومورفیک) بودند و 68 باند در بین حداقل دو نمونه چند شکلی(پلی مورفیک) نشان دادند. اندازه باندهای تولید شده در تمام آغازگرها در محدوده 2372-365 جفت باز تخمین زده شد. به طور میانگین تعداد 14/10 باند به ازای هر آغازگر به دست آمد که تعداد 71/9 باند از آنها پلی مورفیک بودند. بیشترین تعداد باندهای تکثیر شده 12 عدد و به وسیله آغازگر های a-05 وe19 و کمترین باند تکثیر شده با آغاز گرb11 با تعداد 8 باند حاصل گردید. بیشترین درصد چند شکلی(پلی مورفیسم) مربوط به آغازگرهای a-05، a-17، d03، و e-20 با میزان 100 درصد و کمترین درصد پلی مورفیسم در آغاز گر b11به میزان 50/87 درصد مشاهده گردید. با توجه به موارد فوق 4 آغازگر مذکور، آغازگرهای مناسبی برای تکثیر نواحی مختلف ژنوم جمعیت های آویشن و تفکیک جمعیت های این گونه می باشند. در بین جمعیت های مختلف گونه t.eriocalyx، کمترین فاصله ژنتیکی (041/0) و در عین حال بیشترین شباهت(96/0) بین دو جمعیت p2 (اشتران کوه-لرستان) وp3 (درود-لرستان) مشاهده شد. با توجه به اینکه منشاء هر دو جمعیت از یک استان و مناطق جغرافیایی نزدیک بهم می باشد، بنابراین نتیجه حاصله دور از انتظار نیست. دو جمعیت p2 (اشتران کوه-لرستان) و p10 (سقز-کردستان) نیز بیشترین فاصله ژنتیکی (262/0) و در عین حال کمترین شباهت را در بین جمعیت های مختلف گونه t. eriocalyx نشان دادند که نتیجه حاصله می تواند ناشی از فاصله جغرافیایی منشاء دو جمعیت مذکور از یکدیگر باشد. بر اساس نتایج حاصل از تجزیه کلاستر (upgma)، جمعیت های متعلق به دو گونه t.eriocalyx و t. vulgaris در 6 گروه مختلف قرار گرفتند. بر این اساس جمعیت p11 متعلق به گونه t. vulgaris مستقل از جمعیت های گونه t.eriocalyx در یک کلاس جداگانه (کلاس1) مستقر شدند. که با توجه به تفاوت های زیاد دو گونه مذکور این امر دور از انتظار نیست، ضمن اینکه نقش نشانگر مولکولی rapd در جداسازی و دسته بندی گونه های مختلف را نشان می دهد. با توجه به دندروگرام حاصل از تجزیه کلاستر، جمعیت p1 (سفید کوه-ازنا لرستان) در کلاس 2، جمعیت های p2 (اشتران کوه-ازنا لرستان)، p3 (درود- لرستان) و p4 (راسوند-مرکزی) در کلاس 3، جمعیت های p5 (آبسر-استان مرکزی)، p6 (لشکر در ملایر-استان همدان)، p7 (خان گرمز-استان همدان) در کلاس 4، جمعیت p8 (دالاخانی-استان کرمانشاه) در کلاس 5 و جمعیت های p9 (گردنه آریز-استان کردستان) و p10(ملقرنی-استان کردستان) در کلاس 6 قرار گرفتند. نتایج حاصل از تجزیه واریانس داده های مولکولی جمعیت های مورد مطالعه با جای گشت 1000، اختلاف معنی داری بین جمعیت ها در سطح 1 درصد را نشان داد. از کل تنوع موجود در ژرم پلاسم مورد بررسی 32 درصد تنوع مربوط به بین جمعیت ها و 68 درصد تنوع مربوط به درون جمعیت ها بود. بر اساس نتایج بدست آمده تعداد مکان های ژنی شناسایی شده توسط آغازگرهای مورد استفاده در جمعیت های مختلف، بین 33 مکان ژنی در جمعیت های p7و p9 تا 50 مکان ژنی در جمعیت p1 متغیر بود. تعداد مکان های ژنی اختصاصی نیز بین صفر در جمعیت های،p10 p3، p4، p5،p7 تا 3 مکان ژنی در جمعیت p1 متفاوت بود. حداقل درصد پلیمورفیسمی (49/15%) در جمعیت های p9وp10 و جداکثر درصد پلیمورفیسمی (75/57%) در جمعیت p2 مشاهده شد (شکل4-48). نتایج نشان می دهد که جمعیت p2 از بیشترین تعداد آلل های مشاهده شده (577/1) و تعداد آلل های موثر (345/1) و جمعیتp9 از کمترین تعداد آلل های مشاهده شده (154/1) و تعداد آلل های موثر (118/1) برخوردار بودند. میزان یکنواختی هر یک از جمعیت ها از طریق محاسبه نسبت آلل های موثر به آلل های مشاهده شده نیز تعیین گردید که بر این اساس بیشترین مقدار این نسبت (980/0) در جمعیت p10 و کمترین مقدار آن (85/0) در جمعیت p2 مشاهده شد. - از لحاظ دو شاخص تنوع ژنی nei و شاخص اطلاعاتی شانون، جمعیت p2 با 202/0= h و 303/0= i از بیشترین میزان و جمعیت p9 با 065/0= h و 094/0= i از کمترین میزان شاخص های مذکور برخوردار بودند و با توجه به اینکه بالا بودن میزان شاخص های فوق در یک جمعیت بیانگر بالا بودن میزان تنوع ژنتیکی درون آن جمعیت است. بنابراین جمعیت های p2 و p9بترتیب از بیشترین و کمترین تنوع درون جمعیتی برخوردار هستند. بیشترین باند های تشکیل شده و همچنین بیشترین تعداد باندهای متفاوت با فرکانس 5 درصد یا بیشتر، متعلق به جمعیت p1 و کمترین آن ها مربوط به جمعیت های p7 و p9 می باشد ( در این مطالعه جمعیت p11 متعلق به گونه thymus vulgaris بوده، که به عنوان شاهد در نطرگرفته شده است) و در مجموع 408 باند توسط جمعیت های ده گانه مورد مطالعه تشکیل شد. - در مجموع 7 باند اختصاصی در بین جمعیت های مورد مطالعه تشکیل گردید که بالاترین باند اختصاصی ایجاد شده متعلق به جمعیت p1( با 3 باند) بود. - بیشترین و کمترین میزان میانگین هتروزیگوسی مورد انتظار و میانگین هتروزیگوسی مورد انتظار نااریب به ترتیب متعلق به جمعیت p2 و p9 می باشد. 4-11- نتایج بررسی های آناتومی نتایج مطالعات آناتومیک ساقه و برگ در افراد جمعیت های مورد مطالعه در گونه thymus eriocalyx به نتایج زیر منجر شد: - تعداد لایه های اپیدرم ساقه در تمام افراد جمعیت های مورد مطالعه یک لایه می باشد. - تعداد لایه های بافت کلانشیم ساقه در افراد جمعیت های مورد مطالعه متنوع بوده و بین 1 تا 6 لایه متغیر می باشد. - تعداد لایه های بافت پارانشیم ساقه در افراد جمعیت های مورد مطالعه بین 1 تا 5 لایه متغیر می باشد. -تعداد لایه های بافت آبکش ساقه در افراد جمعیت های مورد مطالعه بین 3 تا 5 لایه متغیر می باشد. -مغز ساقه در تمامی نمونه ها تو خالی می باشد. -موقعیت سلول های روزنه نسبت به سلول های اپیدرمی در برگ تمامی نمونه های مورد مطالعه برجسته می باشد. - در برگ های تمامی نمو نه ها هر دو نوع کرک ، یعنی کرک های غده ای بدون پایک یا سپری(گلندها) که شامل 8 تا 12 سلول فوقانی بر روی یک پایه است و کرک های غده ای کپه ای که شامل یک تا سه سلول فوقانی بر روی یک سلول پایه است مشاهده می شود. تمامی سلول های اپیدرمی(سطح تحتانی و فوقانی) دارای الگوی دیواره مواج(مضرسی)، دارای سلول های همراه به تعداد 2 تا، دارای تیپ روزنه ای از نوع دیاستیک، شکل تزئینات بر آمدگی خارجی روزنه و شکل تزئینات حاشیه داخلی برآمدگی خارجی روزنه صاف و شکل کلی سلول های اپیدرمی نامنظم می باشند. همچنین میانگین اندیس روزنه ای سلول های اپیدرمی هر جمعیت محاسبه گردید و مشاهده گردید که سلول های اپیدرمی دارای اندیس روزنه ای متفاوتی در دو سطح تحتانی و فوقانی می باشند. این داده ها با کار های satil et al. (2005) مطابقت دارد. این نتایج موید این است که بررسی های آناتومی ساقه و برگ در سطح گونه و پایین تر تنوع قابل ملاحظه ای را نشان نمی دهند و برای مطالعات در این سطح مناسب نیستند. بحث و نتیجه گیری نهایی • مطالعه بیوسیستماتیکی گونه thymus eriocalyx از جنبه های مختلف (اکولوژیکی، فلوریستیکی، فنتیکی، سیتولوژی، خاکشناسی، شیمیایی، آناتومیکی و داده های مولکولی) و مقایسه موارد فوق با هم منجر به بحث ها و نتایج متنوعی گردید. • داده های فلوریستیک کاملا با داده های ریختی هم خوانی دارند و بیشترین همبستگی را با هم نشان دادند. این هم خوانی بالای داده های ریختی و فلوریستیک بر این اصل استوار است که در جریان تحول یابی گیاهان، گونه هایی با سرشت اکولوژی مشابه، تحت تاثیر ترکیبی از عوامل اکولوژی معین، ترکیب رستنی های معینی را در زیستگاهی ویژه بوجود می آورند که افراد (یا جمعیت ) تاکسون یا تاکسون های مورد بررسی، از نظر فنوتیپ یا ژنوتیپ و یا هر دو با افراد( یا جمعیت) آنها در شرایط اکولوژی دیگر متفاوت است. بنابر این ترکیب رستنی ها در شرایط اکولوژیکی مختلف می تواند به عنوان نشانگر فلوریستیک برای تعیین وجود تنوع درون و بین گونه ای گیاهان به کار رود. • این گونه دارای دو سیتوتیپ (یاخته مونه) می باشد، به طوری که جمعیت های p6, p5, p4, p3,p2, p1 و p8 یک سیتوتیپ با 30=n2 و جمعیت های p10, p9, p7 سیتوتیپ دیگر با 60=n2 را ایجاد کردند. مقایسه این دو سیتوتیپ با شرایط زیستگاهی جمعیت های این گونه، نوعی واگرایی را نشان می دهد به طوری که جمعیت های p6, p5, p4, p3,p2, p1 و p8 در زیستگاه های با خاک کم عمق، با جمعیت های p10, p9, p7 از زیستگاه های با خاک نیمه عمیق از یک دیگر جدا می شوند. این واگرایی را نتایج فلوریستیکی و فنتیکی نیز تا اندازه ای تایید می کنند، به طوری که در این داده ها زیستگاه های p7 و p9 به طور جداگانه و در کنار هم قرار گرفته اند، بنا بر این می توان آنها را به عنوان اکوژن به صورت 2 اکوتیپ از نوع پدودم ، یعنی پدودم خاک های کم عمق (, p3,p2, p1 و p8 ) و پدودم خاک های نیمه عمیق(p10, p9, p7 ) معرفی نمود. • افراد جمعیت های این گونه گیاهی 9 کموتیپ (مونه شیمیایی) در بین خود ایجاد کردند که 7 کموتیپ آن به عنوان کموتیپ های جدید برای این گونه معرفی گردید، که در نوع خود بی نظیر و کم سابقه بود. این نتیجه ما را به این نکته رهنمون می کند که در مطالعات معرفی کموتیپ های یک گونه خاص( حداقل در جنس آویشن)، توجه به تنوع افراد در درون جمعیت های یک گونه از توجه به تنوع موجود در بین جمعیت ها آن گونه مهم تر و اساسی تر است و ما را به نتایج کاملاً متفاوتی می رساند، به طوری که در این مطالعه دیده شد، تنوع ترکیبات شیمیایی در بین افراد جمعیت های مورد مطالعه بیش از تنوع آن ها در بین جمعیت ها می باشد، در حالی که مطالعه تنوع ترکیب های شیمیایی در بین جمعیت ها که به شکل معمول انجام می شود فقط منجر به شناسایی 3 کموتیپ گردید (sefidkon et al , 2005). از لحاظ بازده اسانس هم، این تنوع به خوبی در بین افراد جمعیت های این گونه دیده میشود، به عنوان مثال در حالی که فرد اول از جمعیت p2 دارای بالاترین مقدار اسانس از بین 50 فرد مورد بررسی می باشد، (09/4%) فرد چهارم از همان جمعیت دارای اسانس خیلی کمتری می باشد(5/0%). شاید علت تنوع بیشتر در میان افراد تشکیل دهنده جمعیت ها را بتوان به دلیل دخالت چندین عامل از جمله پیوستگی (linkage) تلاقی خویشاوندی (inbreeding)، و عوامل دیگر دانست (mohammadi & prasanna، 2003). • گا هی افراد جمعیت های یک گونه در یک زیستگاه در بین خود دارای ترکیب های شیمیایی متفاوتی بوده است و بین همدیگر تشکیل کموتیپ را می دهند. این مطالعه ما را به این واقعیت متوجه می کندکه در مطالعات بررسی تنوع، نقطه نظر و نگاه خود را ریزتر نموده و از بررسی های کلی و دیدگاه های کلی نگر اجتناب کنیم. • این تنوع وسیع در افراد جمعیت های گونه مورد مطالعه مخصوصاً از دیدگاه شیمیایی، می تواند علل و عوامل گوناگون داشته باشد، از جمله می توان به ساختار ویژه گلهای گونه مورد بحث اشاره کرد که به دلیل داشتن ساختار ژینودیوسی در گلها و در نهایت هیبریداسیون و سیستم گرده افشانی باز تنوع زیادی را باعث می شود، حتی دیده شده که تنوع ترکیبات شیمیایی در گلهای دو جنسی و گلهای ماده (نر عقیم) با هم متفاوت می باشد. در این خصوص stahl- biskup (2004) مشاهده کرد که محتوای کارواکرول همواره در افراد دو جنسی (هرمافرودیت) در گونه thymus serpylloides subsp: gadorensis بالاتر بود، و یا در thymus baeticus مقدار 1 و 8- سینئول و ترپینن-4- ال در روغن اسانسی گیاهان ماده نسبت به گیاهان هرمافرودیت بیشتر یافت شد (به ترتیب 21 درصد و 11 درصد در عوض 14 درصد و 8 درصد)، در حالیکه مقدار سیترال و ژرانیول در گیاهان ماده نسبت به گیاهان هرمافرودیت پایین تر بودند (7 درصد و 5 درصد در عوض 11 درصد و 21 درصد). • کروموزوم های ریز و کاریوتیپ متقارن بعنوان مشخصه عمومی در گونه مورد مطالعه است. • در جنس آویشن تغییرات سطح پلوئیدی حتی بین جمعیتهای مختلف یک گونه مشاهده می شود. • گونه t. eriocalyx بعنوان یک گونه غنی از ژرانیول ، ژرانیل استات، لینالول، آلفا- ترپینئول ، 1 و 8- سینئول، تیمول، بورنئول ،لیمونن و پاراسیمن است. • در مقایسه با گونه t.vulgaris که بعنوان یک گونه تجاری در اکثر نقاط دنیا کشت می شود گونه t. eriocalyx به عنوان گونه انحصاری فلات ایران، از لحاظ ترکیب تیمول ، لینالول، ژرانیول وژرانیل استات، غنی تر بوده و می توانند بعنوان گونه جایگزین جهت تامین ترکیبات مورد نیاز در صنایع داروئی مورد استفاده قرار گیرند. • در این تحقیق مشاهده شد که ریخت شناسی گیاه لزوماً با کمیت و ترکیب اسانس ارتباطی ندارد، زیرا جمعیت p9 با وجود دارا بودن بیشترین میانگین طول و عرض برگ گل آذینی، بیشترین میانگین نسبت طول به عرض برگ ساقه ای، بیشترین میانگین طول جام و طول کاسه دارای بازده اسانس کم تری (70/0%) بود. • این بررسی نشان داد که اقلیم نیمه خشک فراسرد یک عامل مهم و تاثیر گذار در افزایش میزان اسانس جمعیت p5 می باشد. • در گونه آویشن مورد مطالعه نه تنها بین جمعیت های مختلف, بلکه بین افراد مختلف درون جمعیت ها نیز تنوع ژنتیکی زیادی وجود دارد که این امر بیانگر این است که در برنامه های اصلاحی, گزینش افراد (تک بوته) نیز بایستی مورد توجه قرار گیرد. • در بررسی تنوع ژنتیکی با استفاده از مارکر مولکولی rapd، جمعیت های متعلق به گونه t. vulgaris بواسطه داشتن باندهای اختصاصی از جمعیت های گونه مورد مطالعه یعنی t. eriocalyx جدا شدند که این امر بیانگر این است که نشانگر rapd می تواند ابزار مناسبی برای تفکیک این گونه ها در جنس آویشن باشد. • شواهدی مبنی بر وجود همبستگی بین تنوع ژنتیکی و تنوع فیتوشیمیایی وجود دارد زیرا جمعیت هایی که در بررسی فیتوشیمیایی بواسطه داشتن یک ترکیب شیمیایی خاص از سایر جمعیت ها جدا شده بودند در بررسی ژنتیکی نیز بواسطه داشتن باندهای اختصاصی در لوکوس های خاص متمایز شدند که احتمال می رود این باندهای اختصاصی در ارتباط با این ترکیبات شیمیایی باشند. • برای این گونه گیاهی از نظر اکودیم 7 اکوفن (بوم ریخت) ، 9 کمودیم(از نظر شیمیایی ) و2 پدودم می توان معرفی نمود و نیز با توجه به نتایج مولکولی می توان 5 توپودم از نوع توپوکلاین(توپو کلاین لرستان، توپوکلاین لرستان و مرکزی، توپوکلاین مرکزی و همدان ، توپوکلاین کرمانشاه و توپوکلاین کردستان) معرفی نمود. • نتایج این تحقیق به طور کلی نشان دهنده تنوع درون تاکسونی (within taxon diversity) بسیار بالای گونه مورد بررسی می باشد که به تنوع ژنی در درون یک گونه یا تنوع ژن در درون یک جمعیت اشاره دارد. مطالعه بیو سیستماتیکی گونه مورد بررسی از جنبه های مختلف نشان داد که همواره داده ها به طور صد در صد همدیگر را تأیید نمی کنند و در پاره ای موارد هیچ ارتباط منطقی بین داده های مورد بررسی پیدا نشد، که می تواند به علت عوامل دیگری که از دید این مطالعه دور مانده است، باشد. زیرا در بررسی داده های مورد تحقیق، مخصوصاً عوامل محیطی تأثیر گذار، اگر n عامل موثر باشد همواره 1+n عامل می تواند وجود داشته باشد. این مطلب خود گویای تنوع به شکل بارز آن می باشد. بالا بودن تنوع بالا در این سطح در گونه مورد بررسی شاید ما را به مفهوم تسمیه ای گونه که اوکام و پیروان وی مطرح کرده اند نزدیک می کند که تنها افراد وجود دارند و گونه ها، حالات انتزاعی ساخته ذهن انسانند و طبیعت، افراد را بوجود می آورد (مایر 1384).